腺病毒（AD）构建与包装

定义

腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。

难点：腺病毒表达系统中的难点主要在于怎么将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大（~30kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，成功率很低，因此，目前的腺病毒表达系统基本上都是用同源重组的方法将外源基因或shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。

其具备以下优点：

1、 宿主范围广。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，除可感染几乎所有人的细胞类型外，还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。

2、因腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。

3、 腺病毒具有嗜上皮细胞特性，因目前大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞，这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。

4、病毒滴度高，可用于动物水平的实验。

5、有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因组中；实验中虽然会有一定机率出现RCA（即复制型腺病毒），但由于大多数成人体内都有针对腺病毒的抗体，所以一般危害不大。

一般实验流程图

服务流程

1、构建含有外源基因的腺病毒表达克隆，采用PacI消化纯化质粒使ITRs裸露出来。

2、将腺病毒表达克隆转染293A细胞。收获细胞以制备病毒粗提液。

3、将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。确定病毒滴度。

4、将病毒上清加入靶细胞中

5、分析重组目的蛋白的表达

客户提供

1、含有目标基因的质粒（提供测序图谱）或所要表达的目的基因的名称，序列；

2、所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化

3、若需要检测外源基因的表达，如需要请提供相应的抗体

我们提供

提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的腺病毒储存液，重组后的腺病毒载体质粒