免疫组化

2019-05-09

免疫组化(IHC)


定义


免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。


一般实验步骤


1、脱蜡:依次将载玻片放入二甲苯I-二甲苯II-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min。

2、抗原修复:脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

3、血清封闭:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900µlPBS:100µl血清封闭液)。

4、加一抗:将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

5、加二抗:将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。

6、加SABC:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990µlPBS:10µlSABC)。

7、加显色剂:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)A:DAB B:H2O2 C:磷酸缓冲液

8、复染:将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。

9、脱水:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。

10、封片:用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。


服务内容

1、 常规免疫组织化学染色。

2、实验结果显微照相(根据需要可附图片)。

样品要求

1、客户需提供石蜡切片及一抗。

2、用于石蜡包埋的组织,活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。用于冰冻切片的组织,取材后应立即放如液氮冷冻,然后放入-80℃保存。

终产品


1、切片显微图片一张,如需另外拍片,按10元/张计,如需分析,费用请致电咨询。


2、染色后的切片;

3、完整实验报告。

服务说明

1、采用免疫组化试剂盒进行检测,DAB显色。

2、预实验与正式试验均按照切片张数进行收费。


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